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医用臭氧对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的杀灭作用
来源:西安戴美医疗科技有限公司 | 作者:本站 | 发布时间:2011-11-02 | 浏览:4246次关闭此页
 
医用臭氧对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的杀灭作用
邱勤业, 余斌
(南方医科大学南方医院创伤骨科,广东 广州 510155)
 
摘要:目的 研究医用臭氧对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的杀灭作用,为医用臭氧的临床应用提供初步依据。方法 取实验菌用金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌于无菌生理盐水中制备菌悬液,麦氏比浊法调整含菌量,以不同浓度医用臭氧在不同时间点分别作用于两种菌悬液,计算两种细菌的杀灭率。结果 不同浓度医用臭氧对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌均有较高的杀灭率,浓度越高对细菌的杀灭率越高(F=5278.00,3293.26,5743.73,p<0.05);同一医用臭氧浓度作用下,随着作用时间延长,金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的杀灭率均显著提高,作用时间大于或等于10min时,两种细菌的杀灭率均为100%。结论 一定浓度下医用臭氧作用10min以上可有效杀灭体外中的金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌,提示可在允许条件下,通过提高医用臭氧浓度及作用时间,增强杀菌效果。
关键词:医用臭氧;细菌;杀菌作用;浓度
The study of medical ozone to sterilize Staphylococcus aureus and Escherichia coli.
Qiu qin-ye, Yu bin
Department of Trauma Orthopedics,,nanfang hospital,,Southern Medical University,Guangzhou 510155,China
 
Abstract :Objective  To study medical ozone to sterilize Staphylococcus aureus and Escherichia coli,and to provide an evidence for the clinical application of medical ozone. Methods Experimental bacteria contain Staphylococcus aureus and Escherichia coli, . Each bacterium was prepared bacterial suspension with sterile saline, and adjusted the amount of bacteria by the method of McNamara’s turbidimetry. Different concentrations of medical ozone were transmitted to each bacteria at different time point and the disinfection rate were calculated. Results Different concentrations of medical ozone sterilized Staphylococcus aureus and Escherichia coli significantly. The disinfection rate was up-regulated with the change of the concentration of medical ozone (F = 5278.00, 3293.26, 5743.73, p <0.05). Meanwhile, under the same concentration of medical ozone, the disinfection rate of Staphylococcus aureus and Escherichia coli were significantly improved in different time point. When the time point was greater than or equal to 10 minutes, Both of the disinfection rate of two kinds of bacteria were 100 %. Conclusion A certain concentration of medical ozone which was used more than 10 minutes can effectively kill Staphylococcus aureus and Escherichia coli in vitro, which may be allowed by increasing the concentration and time of medical ozone to enhance the disinfection rate.
Key words: medical ozone; bacteria; sterilization; concentration
 
 

作者简介:邱勤业,男,(1975-),硕士研究生,手机:13719068406,E-mail:qiuqinyedeng@126.com;通讯作者:余斌,男,教授,博士生导师,电话:020-61641746,E-mail:yubinol@163.com
基金项目:广东省自然科学基金(8151051501000079)
臭氧(Ozone)具有强氧化性,可有效杀灭或灭活水中及物体表面包括G+或G-菌、真菌、原虫、甲型肝炎病毒(HAV)、人免疫缺陷病毒(HIV)等多种微生物[1-2]。医用臭氧用于消毒、杀菌的前提是一定浓度和作用时间,但是医用臭氧在何种条件下杀菌效果最好,同时医用臭氧对不同细菌的杀灭作用是否有差异,目前相关研究较少。本实验初步研究不同浓度臭氧在不同作用时间条件下对临床常见的金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的体外杀灭作用,为医用臭氧的临床应用提供依据。
 
材料与方法
1.1材料
试验菌为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC25923、大肠埃希菌(Escherichia coli)ATCC25922,由南方医科大学附属南方医院检验医学科微生物实验室提供。无菌挑取菌种的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物(18~24h),混悬于无菌生理盐水制备成菌悬液,分别制备金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌菌悬液,麦氏比浊法调整含菌量为0.5麦氏浓度,取各组菌悬液1 ml稀释至10 ml,每组为4个标本。按照不同浓度不同作用时间分别编号。
1.2医用臭氧的发生及通路
医用臭氧由医用纯氧经臭氧发生器(德国德国赫美斯多功能臭氧治疗系统,型号:Humazon Promedic)制备, 是臭氧与纯氧的混合气体,产生的臭氧浓度可连续精确调控在0~75μg/ml范围内,针头滤器(0.2μm孔径聚醚砜膜,美国PALL公司生产),再与静脉留置针(16G-150mm,购自上海上医康鸽医用器材有限责任公司)连接后通入菌悬液中,臭氧试验浓度分别是10、30、50μg/ml。作用时间为5、10min。试验环境温度为25±3 ℃, 相对湿度为50%~80%,工作平台为海尔牌生物安全柜(HR60-IIA2)。
1.3悬液定量杀菌试验
实验组均通入10、30、50 μg/ml臭氧作用5、10、15 min,取各组的稀释液1 ml接种平皿,倾注普通营养琼脂后于37℃培养24 h,进行活菌菌落计数;对照组均加入等量含菌量为0.5麦氏浓度的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌及混合菌悬液1ml以生理盐水稀释至10 ml,取各级稀释液1 ml接种细菌培养皿,倾注普通营养琼脂,于37℃培养24 h后取适宜计数的平皿计数不同培养皿的菌落数。每组标本做7个培养皿重复,取其平均值。杀菌率=菌落数/平均值。
1.4  统计学分析
数据以x(_)±s表示,采用SPSS13.0软件对数据进行分析,用多因素析因设计方差分析对处理因素和分组作统计分析,用单因素方差分析对同一组间不同浓度或不同时间点的杀菌率进行比较,组内任意两组间差异采用LSD法比较,P<0.05为有统计学差异。
结果
应用多因素析因分析后发现,两种细菌间及各浓度臭氧作用间均存在明显统计学差异(F值分别为14130.53,211.81,55.15,P<0.05),进一步采用方差分析(表1)。
2.1不同浓度医用臭氧对不同细菌的杀灭作用
不同浓度医用臭氧对金黄色葡萄球菌的杀灭率具有显著性差异(F=5278.00,p<0.05)(表1),浓度越高对细菌的杀灭率越高(图1),浓度为50μg/ml作用10min对金黄色葡萄球菌的杀灭率为100%(表1)。
不同浓度医用臭氧对大肠埃希菌的杀灭率具有显著性差异(F= 3293.26  ,P<0.05)(表1),浓度越高对细菌的杀灭率越高(图1),浓度为50μg/ml作用10min对大肠埃希菌的杀灭率为100%(表1)。
1   5min不同浓度医用臭氧对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的杀灭率(%
分组
10μg/ml
30μg/ml
50μg/ml
F
P
金黄色葡萄球菌
30.93±0.67
67.46±1.43
100±0.00
5728.00
0.000
大肠埃希菌
41.77±1.23
79.77±1.29
100±0.00
3293.26
0.000
t            
142.88
90.93
 
 
 
P
     0.00
0.00
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1   5min不同浓度医用臭氧对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的杀灭率(%
2.2相同浓度医用臭氧对不同细菌的杀灭作用
相同浓度医用臭氧对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的杀灭率具有显著性差异(F=142.88,90.93 , p<0.05),30μg/ml以下浓度医用臭氧对大肠埃希菌的杀灭率较金黄色葡萄球菌的杀灭率高,当医用臭氧浓度升至50μg/ml时对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的杀灭率均为100%(表1,2)。
2.3不同作用时间医用臭氧对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的杀灭作用
    相同医用臭氧浓度下5min和10min作用时间对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的杀灭率有明显差异,随作用时间的延长杀菌率增高(表2),作用时间为10min和15min对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的杀灭率均为100%;当医用臭氧浓度升至30μg/ml,作用时间为10min以上时对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的杀灭率均为100%(表2)。
不同作用时间医用臭氧对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的杀灭率(%
分组
浓度
5min
10min
15min
t
P
 
金黄色葡萄球菌
10μg/ml
30.93±0.67
67.46±1.43
100±0.00
100±0.00
100±0.00
100±0.00
    100±0.00
42620.59
8935.92
0.00
0.00
30μg/ml
100±0.00
50μg/ml
100±0.00
 
 
 
大肠埃希菌
10μg/ml
41.77±1.23
79.77±1.29
100±0.00
100±0.00
100±0.00
100±0.00
100±0.00
2063.03
982.63
0.00
0.00
30μg/ml
100±0.00
50μg/ml
100±0.00
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3讨论
臭氧(O3)是一种活性氧, 具有很强的氧化性, 可自行分解成稳态的氧分子(O2) 和单个新生态氧原子(O) 。单个氧原子具有极强的氧化性, 其强氧化作用能杀灭多种致病微生物, 而多余的氧原子在30min 后又会转化成稳态的氧分子, 不会产生有毒残留物[1-3]
目前, 多数学者认为臭氧灭活微生物的机制是通过生物化学氧化反应而影响生物细胞中物质的交换。具体灭活机制可能有以下3 种形式: ①臭氧能氧化分解细菌细胞内部的葡萄糖氧化酶; ②臭氧直接与细菌、病毒发生作用, 破坏其细胞内DNA和RNA,分解蛋白质、脂质类和多糖等大分子聚合物, 使微生物的新陈代谢和繁殖过程遭到破坏; ③臭氧能渗透细胞膜组织,穿入菌体内部,侵入细胞膜,作用于外膜脂蛋白和内部的脂多糖,使细胞发生通透性畸变,导致细胞溶解死亡,并且使死亡菌体内的遗传基因、寄生菌种、寄生病毒粒子、噬菌体、支原体及热原等溶解变性而死亡。臭氧对微生物的杀灭率受温度、接触时间和臭氧浓度等主要因素的影响[4]
臭氧的治疗具有双面性,臭氧的氧化程度与臭氧的浓度呈正比,浓度过低疗效欠佳,浓度过高则对周围组织产生强刺激,甚至导致组织器官的损伤[4]。所以医用臭氧在应用时应限定在一个浓度范围内,Bocci等[2]通过实验得出浓度在1~80 μg/ml以内的医用臭氧,对机体红细胞无明显破坏作用,因此,一般应用医用臭氧的浓度<80 μg/ml,通常在20~50 μg/ml之间。所以本研究采用的臭氧浓度分别为10、30、50 μg/ml,以保证臭氧浓度在安全范围内。
本研究表明,安全范围内的医用臭氧对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌均有很好的杀灭作用,浓度越高对细菌的杀灭作用越好,相同医用臭氧浓度下对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的杀灭率随作用时间的延长而增高;当医用臭氧浓度升至30μg/ml,作用时间为10 min 以上时对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的杀灭率均为100%。汪饶饶等[5]研究也发现,随着医用臭氧浓度的升高及作用时间的延长,体外细菌的杀灭率也不断升高。但是,魏兰芬等[6]研究发现,动物体内存在多种氧化还原系统,这些系统对臭氧的作用机制有一定的影响,因此,医用臭氧对体内细菌的杀灭作用尚要行进一步研究。
另外,本研究发现在相同浓度(<30 μg/ml)医用臭氧作用下,大肠埃希菌的杀灭率较金黄色葡萄球菌的杀灭率好,考虑可能不同菌群对医用臭氧的敏感度有所不同,或臭氧对不同菌群的杀灭机制有所不同,至于具体的杀灭机制需进一步研究。同时,本实验只是对一种革兰氏阳性菌和一种革兰氏阴性菌进行实验,故对革兰氏阴性菌的杀灭作用与革兰氏阳性菌的杀灭作用尚需进一步研究。
总体看来,在安全范围内,随着医用浓度臭氧的升高及作用时间的延长,大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的灭菌率均显著升高,提示在体内作用时,可考虑通过提高医用臭氧浓度及延长作用时间,增强杀菌效果。
 
参考文献
[1] Nogales CG, Ferrari PH, Kantorovich EO,et al. Ozone therapy in medicine and dentistry[ J ]. Contemp Dent Pract, 2008, 9(4):75-84.
[2] Bocci V. Ozone as Janus: this controversial gas can either toxic or medically useful [J]. Mediators Inflamm, 2004, 13(1):3-11.
[3] Bocci V. Ozone as a bioregulator. Pharmacology and toxicology of ozone therapy today [ J ]. J Biol Regul Homeost Agents,1996 , 10 : 31.
[4] 林爱红,饶健,秦彦氓,等.臭氧杀菌效果的影响因索分析[J]. 湖北预防医学杂志,2002,13 (5):7-8.
[5] 汪饶饶,尚光伟,胡林凤,等. 臭氧对4 种细菌的灭活作用[J]. 上海口腔医学,2008,17(1):92-95.
[6] 魏兰芬,林军明,张峰,等.臭氧水溶液杀菌效果实验室观察[J].中国公共卫生,2006,16(1):67-68.

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